引言

病毒核酸的多重检测是早期感染筛查的关键，但传统方法（如PCR、抗体检测）存在样本用量大（微升级）、通量低、难以同时区分多种病毒（如HIV-1/HIV-2共感染）的痛点[1,2]。droplet microarray（DMA）平台凭借超微量反应特性，结合二硫化钼（MoS₂）纳米片的荧光淬灭能力，为解决这一难题提供了新思路。本研究开发“MoS₂修饰树枝状大分子液滴微阵列（MoS₂-DMA）”传感平台，通过I.DOT非接触式纳升级移液技术精准控制液滴打印，基于荧光共振能量转移（FRET）机制，实现150 nL样本量下HIV-1/HIV-2核酸的同步检测，还可扩展至SARS-CoV-2、流感A等5种病毒基因的筛查，检测限（LOD）低至50pM，为临床快速、高通量病毒筛查提供了革新性工具。

实验方法

1、核心平台与传感体系设计

采用7.5×2.5cm玻璃载玻片，通过树枝状大分子修饰构建“疏水性边界-亲水性斑点”DMA芯片（含14 × 14个1 mm × 1 mm亲水斑点，间距0.5 mm，图1a）。以MoS₂纳米片为FRET淬灭剂（acceptor），FAM标记的HIV-1探针、Cy5标记的HIV-2探针为荧光供体，构建“关-开”型传感体系；同时可扩展至SARS-CoV-2（ORF1ab、N基因）、流感A（M基因）的检测，通过多色荧光与空间分区实现多重筛查。

图1. (a) 基于表面上具有亲水型斑点阵列的图案化树枝状载玻片的MoS2-DMA传感平台的制造工艺。(b)在所制备的MoS2-DMA平台上形成的液滴阵列；液滴的体积为150 nL。(c)以检测HIV-1和HIV-2DNA序列为例，MoS2-DMA平台用于同时检测多个目标探针的传感机制。

实验操作与I.DOT核心应用

MoS₂涂层制备：通过I.DOT将100 nL浓度为200 μg/mL的MoS₂悬液（乙醇/水=8:2）精准打印至DMA亲水斑点，室温放置1-2天干燥，形成60-100 nm厚的MoS₂纳米层（图1a流程，图2e-f）。I.DOT的精准分配确保每个斑点的MoS₂负载量均一，为后续淬灭效率稳定奠定基础。

图2.(a)MoS2纳米片的电子显微镜图像，(b)动态光散射(DLS)测量的MoS2纳米片的尺寸分布，(c)MoS2纳米片的UV-Vis吸光度以及FAM和Cy5染料的荧光发射光谱，(d)半胱胺修饰的树枝状大分子斑点表面的原子力显微镜图像，(e)MoS2纳米片状斑点表面的原子力显微镜图像，以及(f)半胱胺修饰的树枝状大分子斑点表面和MoS2纳米片状涂层斑点表面的表面轮廓。

FRET传感体系构建：使用I.DOT打印150 nL浓度为50 nM的荧光探针溶液（FAM-HIV-1或Cy5-HIV-2，混合检测时各25 nM）到MoS₂涂层斑点，在控湿暗室孵育1h，探针通过范德华力吸附于MoS₂表面，荧光被淬灭（图3b、图4a）。

图3. (a) 非接触式液体移液技术在胱胺修饰（左）和MoS₂纳米片涂层（右）位点上形成的150纳升液滴形态示意图。(b) 在MoS₂纳米片涂层位点表面打印荧光标记捕获探针以构建FRET传感系统的方案图，以及吸附在MoS₂纳米片涂层位点表面的荧光标记捕获探针的原子力显微镜（AFM）图像。(c) 胱胺DMA与MoS₂纳米片涂层DMA表面标记捕获探针的荧光成像对比图。上述图像的比例尺均为1毫米。

图4. (a) 荧光标记捕获探针与MoS₂纳米片调控比例示意图，用于实现最佳猝灭效率。荧光标记探针（50 nM）在150 nL液滴中孵育，液滴分布于经不同浓度（0−250 μg/mL）MoS₂纳米片修饰的100 nL亲水位点表面。(b) FAM标记捕获探针-1（50 nM）在系列浓度MoS₂纳米片包覆亲水位点的荧光成像图。(c) Cy5标记捕获探针-2（50 nM）在系列浓度MoS₂纳米片包覆亲水位点的荧光成像图。(d) 两种荧光标记探针（捕获探针-1和捕获探针-2）在MoS₂纳米片梯度浓度修饰位点的猝灭效率对比。

样本检测与信号读取：通过I.DOT将150 nL靶标溶液（HIV或其他病毒基因，浓度10-50nM）打印至传感斑点，37℃暗室孵育1h；靶标与探针特异性杂交形成双链，导致探针与 MoS₂表面的亲和力减弱，从而脱离 MoS₂表面，荧光恢复（“开”状态）；使用荧光显微镜（KeyenceBZ-9000）分别在488nm（FAM）和668nm（Cy5）激发下检测信号（图1c机制，图5a/b检测流程）。

图5. (a) MoS₂-DMA FRET传感平台在目标探针-1（浓度范围10至50 nM）存在下的荧光强度变化.(b) MoS₂-DMA FRET传感平台在目标探针-2（浓度范围10至50 nM）存在下的荧光强度变化(c) 传感位点荧光强度与目标探针浓度的定量分析关系.(d) 相对荧光恢复率随目标探针-1对数浓度变化的曲线图.(e) 相对荧光恢复率随目标探针-2对数浓度变化的曲线图.(f) MoS₂-DMA FRET传感平台对HIV-1/HIV-2目标探针的特异性测试（使用四碱基错配探针、HBV探针及HCV探针作为对照）.

实验结果

1、平台基础验证：

I.DOT 保障体系均一性与稳定性

MoS₂纳米片特性：经超声剥离的MoS₂平均粒径90nm，UV-Vis吸收覆盖UV至近红外，与FAM（520 nm）、Cy5（670 nm）的发射光谱高度重叠，满足FRET能量转移需求（图2a-c）；通过I.DOT打印涂层后，亲水斑点表面形成均匀的MoS₂纳米层，厚度60-100 nm（图2e-f），多次清洗后仍稳定附着。

液滴与淬灭效率：I.DOT打印的150 nL液滴在亲水斑点上几何稳定（图3a），无明显蒸发（24h体积变化<5%）；MoS₂对荧光探针的淬灭效率随浓度升高而提升，当I.DOT打印“100 nL 200 μg/mLMoS₂+150 nL 50 nM探针”时，淬灭效率>95%，为低背景检测提供保障（图4d）。

2、HIV 单靶标检测：

高灵敏与高特异性

灵敏度：当靶标浓度为10-50 nM时，荧光强度随浓度升高呈线性增长，HIV-1、HIV-2的LOD分别为1.24 nM和1.26 nM；结合微型光电探测器优化后，LOD可进一步降至50 pM（图5a-e），远低于临床感染阈值。

特异性：四碱基错配探针、HBV/HCV靶标均未引发明显荧光恢复，信号强度仅为HIV靶标的1/5-1/6，证明平台可特异性区分目标病毒（图5f）。

3、HIV 双靶标同步检测：

空间分区实现精准区分

设计4 × 4DMA阵列，分为HIV-1检测区、HIV-2检测区、两者混合区及阴性对照区（图6a）。I.DOT打印的混合样本（HIV-125nM+HIV-225 nM）在混合区呈现黄色荧光（FAM绿色与Cy5红色叠加），而单一靶标区仅对应单色荧光（图6b）；6次重复实验的相对荧光强度（RFI）变异系数<5%，证明检测稳定性（图6c）。

图6. (a) MoS₂-DMA传感平台检测HIV-1/HIV-2核酸的示意图.(b) MoS₂液滴微阵列检测HIV-1/HIV-2核酸的荧光显微图像（滴液标识参见(a)）.(c) 双重HIV-1/HIV-2核酸检测平台的重复性实验分析误差棒表示相对荧光强度（RFI）±标准差（P < 0.001：针对HIV-1、HIV-2及HIV-1/HIV-2混合样本的目标探针检测；P > 0.05：针对错配核酸的检测。采用学生氏非配对双尾t检验，n = 6）

4、多病毒基因筛查：

扩展至 5 种靶标的多重检测

利用 “多色荧光+空间分区” 策略，该平台成功检测 5 种病毒基因：HIV-1、HIV-2、SARS-CoV-2 ORF1ab、SARS-CoV-2 N、流感 A M 基因。不同基因的荧光信号随浓度（0.5-10 nM）升高而增强，且无交叉干扰，证明其在多病毒共感染筛查中的应用潜力（图7）。

图7. MoS2-DMA FRET传感平台，用于检测不同病毒的五个基因靶标探针。

总结与讨论

本研究开发的MoS₂-DMA FRET传感平台，通过I.DOT非接触式纳升级移液技术实现了病毒核酸检测“超微量、高通量、多重化”的突破，其核心价值显著：作为纳升级液滴精准分配的核心工具，I.DOT可实现“100 nL MoS₂悬液-150 nL荧光探针-150 nL样本”的均一打印，解决了传统手动加样的体积误差（±5%vs±20%），是该平台淬灭效率优化（>95%）、检测重复性（CV<5%）和多重筛查准确性的关键支撑；同时，相比传统方法，该平台具备显著综合优势，样本用量仅150 nL（为96孔板的1/300），单芯片含588个独立斑点以实现高通量检测，检测限（LOD）低至50pM且可特异性区分错配序列与其他病毒，还能通过多色荧光与空间分区实现5种以上病毒基因的同步检测，完美契合临床快速筛查需求；

此外，平台应用前景广阔，目前已验证对HIV、SARS-CoV-2、流感A的检测能力，未来结合等温扩增技术可进一步将灵敏度提升至fM级，还可拓展至乙肝、丙肝等更多病原体检测，为突发传染病应急检测、临床多病毒共感染诊断提供“一站式”解决方案。可见，I.DOT与MoS₂-DMA的协同作用，不仅革新了病毒核酸检测的微型化路径，更推动了“纳升级高通量传感”在临床诊断中的落地，为精准医疗提供了重要技术支撑。