聚酰亚胺（PI）是微电子领域中常用的聚合物。近年来，已开发出许多基于PI的柔性神经接口，用于减少刚性植入物与柔软神经组织之间的机械失配。大多数方法采用非光敏PI，此前已证明其具有生物相容性。然而，光敏聚酰亚胺（PSPI）将显著简化器件制造，但其生物相容性仅有少量报道。在本研究中，根据ISO-10993-5标准，使用BHK-21成纤维细胞体外评估了旋涂PSPI（HD MicroSystems PI-2771）和传统PI（HD MicroSystems PI-2525）薄膜的细胞毒性。PSPI分别在200°C（PI-2771-200）和350°C（PI-2771-350）下固化后进行了测试。PI薄膜表面在粗糙度、能量和zeta电位方面进行了表征，这些因素被认为会影响细胞-材料相互作用。PI-2525薄膜的总表面自由能（SFE）及其极性和色散分量值显著（p < 0.001）高于PI-2771-200（25.6 mJ/m²）或PI-2771-350薄膜（26.2 mJ/m²）。PI-2771的固化温度对zeta电位值有显著影响（p < 0.001），但对表面能（p = 0.091）或粗糙度（p = 0.717）无显著影响。MTS增殖试验和活/死染色的结果显示，PSPI几乎与传统PI和聚乙烯（阴性对照）一样无细胞毒性。BHK-21细胞在所有测试PI材料上的形态和铺展相似。总之，PSPI似乎是一种有前景的生物相容性材料，但需要进一步的体外和体内研究来阐明长期效应。

一、引言

聚酰亚胺（PI）是微电子工业中常用的聚合物。最近，已开发出许多基于PI的柔性神经接口，用于减少刚性植入物与柔软神经组织之间的机械失配。大多数方法采用非光敏PI，此前已证明其具有生物相容性。然而，光敏聚酰亚胺（PSPI）将显著简化器件制造，但其生物相容性仅有少量报道。在本研究中，根据ISO-10993-5标准，使用BHK-21成纤维细胞体外评估了旋涂PSPI（HD MicroSystems PI-2771）和传统PI（HD MicroSystems PI-2525）薄膜的细胞毒性。PSPI分别在200°C（PI-2771-200）和350°C（PI-2771-350）下固化后进行了测试。PI薄膜表面在粗糙度、能量和zeta电位方面进行了表征，这些因素被认为会影响细胞-材料相互作用。PI-2525薄膜的总表面自由能（SFE）及其极性和色散分量值显著（p < 0.001）高于PI-2771-200（25.6 mJ/m²）或PI-2771-350薄膜（26.2 mJ/m²）。PI-2771的固化温度对zeta电位值有显著影响（p < 0.001），但对表面能（p = 0.091）或粗糙度（p = 0.717）无显著影响。MTS增殖试验和活/死染色的结果显示，PSPI几乎与传统PI和聚乙烯（阴性对照）一样无细胞毒性。BHK-21细胞在所有测试PI材料上的形态和铺展相似。总之，PSPI似乎是一种有前景的生物相容性材料，但需要进一步的体外和体内研究来阐明长期效应。

二、材料与方法

2.1 样品制备

非光敏PI（PI-2525）和光敏PI（PI-2771）购自HD MicroSystems并按供应状态使用。PI-2771主要基于与PI-2525相同的主链化学，即二苯甲酮四甲酸二酐/氧二苯胺/间苯二胺的聚酰胺酸，但也含有悬挂的光反应性侧基。两种产品均使用N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）作为溶剂。高密度聚乙烯和天然乳胶橡胶（Small Parts Inc.）分别用作细胞实验中的阴性和阳性对照材料。

PI-2525和PI-2771薄膜在低加速度下旋涂（5000 rpm，60 s）到2英寸p型<100>硅晶圆（Si-Mat Landsberg am Lech）上，硅晶圆预先在200°C烘烤20分钟以去除水分，并涂覆VM-651（HD MicroSystems）以改善聚酰亚胺与硅之间的粘附。然后，PI-2771薄膜在热板上于100°C预烘烤90秒，暴露于365 nm紫外光（Karl Suss MA45），在环戊酮（Sigma-Aldrich Inc.）中显影，并用丙二醇甲醚乙酸酯（Sigma-Aldrich Inc.）冲洗。一部分PI-2771涂覆晶圆（总共8片中的4片）和所有PI-2525涂覆晶圆（4片）通过在烘箱中固化进行聚合，温度在60分钟内逐渐升至350°C，然后在该温度下保持60分钟。另一部分PI-2771涂覆晶圆在较低温度（200°C）下烘烤。因此，制备并测试了三种不同的材料组：PI-2525、在200°C下烘烤的PI-2771（PI-2771-200）和在350°C下烘烤的PI-2771（PI-2771-350）。

2.2 样品预处理

使用包括金刚石刀的定制装置将硅晶圆切割成7 mm × 7 mm的碎片。切割后，将碎片在7×洗涤剂中超声几分钟，并在乙醇和无菌水中反复冲洗。

2.3 原子力显微镜（AFM）表面表征

在环境温度和湿度下使用PSIA XE-100（Park Systems Corp.）原子力显微镜分析表面形貌。AFM以非接触模式进行，其中使用铝涂层硅悬臂（Acta-10，ST Instruments B.V.）在2 μm × 2 μm的区域上探测表面。使用仪器分析软件（XIA）在每个样品的六个随机区域上确定平均表面粗糙度（Ra）和峰谷粗糙度（Rpv）值。

2.4 接触角和表面能测量

在22°C和45%相对湿度下，使用包括带数码显微镜的光学显微镜的定制装置，通过座滴法确定接触角。为了获得总表面自由能（SFE）及其极性/色散分量，在将液滴（15 μl）放置在样品表面上后5秒内测量一种极性液体（水）和一种非极性液体（二碘甲烷）的接触角。存储液滴图像并使用图像分析软件GIMP确定五个座滴的左右边缘接触角，以计算平均接触角。使用Owens-Wendt模型估算色散D^S和极性P^S分量：

(1 + cos θ)γ^L = 2((D^S D^L)^(1/2) + (P^S P^L)^(1/2))

其中θ是测量的（平均）接触角值，上标D标记色散分量，P标记表面张力的极性分量，而下标S和L分别代表固体和液体。γ^L、D^L和P^L分别代表总SFE及其色散和极性分量。总SFE（γ^S）是其色散和极性分量的总和。

2.5 Zeta电位测量

进行zeta电位测量以估算PI薄膜在液体中的现有界面电荷。当电解质循环通过测量池并被强制在压力下直接流过由两个样品表面形成的小间隙时，产生zeta电位。电化学双层中电荷的比较运动发生并产生zeta电位。使用配备可调间隙池和两个放置在样品两侧的Ag/AgCl电极的动电分析仪（SurPASS，Anton Paar GmbH）进行流动电流测量。样品之间的间隙调整为约100 μm。测量使用0.001 M KCl作为电解质溶液，在固定pH 7.4 ± 0.2下进行。根据Helmholtz-Smoluchowski方程从流动电流测量中获得zeta电位（ζ）：

ζ = (dI/dp) × (η / (ε × ε₀)) × (L / A)

其中dI/dp是流动电流与压力的斜率，η是电解质粘度，ε₀是真空介电常数，ε是电解质的介电常数，L是流动通道的长度，A是流动通道的横截面积。

2.6 细胞培养

幼仓鼠肾成纤维细胞（BHK 21，克隆13，HPA Culture Collections）在补充有10%胎牛血清（PAA）、50 μg/ml抗坏血酸（Sigma）、2 mM L-谷氨酰胺（PAA）、20 IU/ml青霉素（Euroclone）和200 μg/ml硫酸链霉素（Euroclone）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，Euroclone）中培养。将含有5.0 × 10⁴ cells/ml培养基的细胞接种到样品（7 mm × 7 mm）表面，在24孔细胞培养板（Greiner Bio-One）中培养。细胞培养物在37°C下用5% CO₂气体培养24小时。

2.7 MTS试验

使用基于MTS的细胞增殖试验（CellTiter 96® Aqueous One Solution Reagent，Promega）作为比色法来评估不同聚酰亚胺和对照材料的细胞毒性效应。该试验基于MTS（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑）在吩嗪硫酸甲酯（PMS）存在下在活跃运作的线粒体中还原为水溶性甲臜产物。通过测量490 nm处的吸光度来确定形成的甲臜量，这与活细胞数量直接成正比。24小时细胞培养期后，将样品转移到未使用的孔中并加入新鲜培养基，然后加入MTS试剂（200 μl）。孵育1小时后，去除培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗孔，并用ELISA读数器在490 nm处测量吸光度。通过将光密度值归一化到最高测量值来确定相对细胞数。每种材料至少使用三个样品，测试重复两次。

2.8 细胞活力试验

使用两种荧光探针的组合评估样品中培养的成纤维细胞的活力。将样品在含有60 μM浓度的细胞不可渗透DNA结合染料碘化丙啶（Sigma）和10 μM浓度的细胞可渗透荧光素二乙酸酯（Fluka）的PBS溶液中孵育5分钟。用PBS冲洗后，使用共聚焦扫描仪（PerkinElmer Life Sciences，Wallac-LSR）在Nikon Eclipse TE300显微镜上观察样品，荧光素使用488/10 nm（激发）和525/50 nm（发射）波长，碘化丙啶使用568/10 nm（激发）和607/45 nm（发射）波长。使用Image J软件计数死细胞（红色染色）密度（细胞核/mm²）和活细胞（绿色染色）表面积。分析了每种材料组至少八个平行样品的随机拍摄图像。在死细胞（细胞核/mm²）和活细胞（μm²）估算中使用不同单位是必要的，因为只有死细胞的细胞核被染成红色，而活细胞的整个细胞质被绿色染色。此外，由于活细胞密度如此之高以至于无法再相互分离，因此无法估算活细胞数量，Image J等图像分析程序无法将其可靠地计算为单独颗粒。此外，确定了每个样品组被活细胞覆盖的平均表面积。

2.9 培养细胞的扫描电子显微镜分析

培养24小时后，用2.5%（w/v）戊二醛（Sigma）在二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中固定细胞，并用乙醇梯度脱水，然后用六甲基二硅氮烷（Sigma）处理。使用扫描电子显微镜Philips XL30 ESEM-TMP（Fei Company）在8-15 kV的加速电压下检查样品上的BHK-21细胞，在使用Sputter Coater E 5100（Polaron Equipment Ltd.）涂覆薄金层后。

2.10 统计分析

结果表示为平均值±标准差或平均值±平均值的标准误。使用单因素方差分析（SPSS 16.0软件），随后进行Tukey事后检验，以确定观察到的材料之间差异的统计显著性。p < 0.05被认为是显著的。

三、结果

3.1 表面表征

通过AFM确定的平均表面粗糙度（Ra）和峰谷粗糙度（Rpv）值，以及通过座滴法在不同PI材料上获得的接触角，列于表1。获得的粗糙度值都非常小，即均低于4 nm。然而，PI-2525表面的Ra和Rpv值显著高于PI-2771-200和PI-2771-350的对应值（所有p < 0.001）。有些令人惊讶的是，为PI-2771选择的固化方案（200°C vs. 350°C）对Ra（p = 0.830）或Rpv（p = 0.717）没有统计学显著影响。

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图1. 使用Owens-Wendt模型计算的PI表面的总表面自由能（SFE）及其色散（DISP）和极性分量。误差线表示标准差。#与其他PI材料有显著差异（p < 0.001）。

PI-2771两种薄膜上水和二碘甲烷的接触角均显著高于PI-2525薄膜（所有p < 0.001，表1）。使用Owens-Wendt模型估算的总表面自由能以及极性和色散分量值，PI-2771-200和PI-2771-350薄膜均显著低于PI-2525薄膜（所有p < 0.001），表明PI-2771更具疏水性（图1）。相比之下，为PI-2771选择的固化温度对SFE（p = 0.206）、色散分量（p = 0.932）或极性分量（p = 0.091）的影响在统计学上不显著（图1）。

深圳市富临神通科技有限公司是HD MicroSystems中国经销商，我们为客户提供晶圆、光刻胶。

在固定pH 7.4下测量的PI-2525、PI-2771-200和PI-2771-350的zeta电位值分别为-59.9 ± 0.3 mV、-66.2 ± 1.6 mV和-54.2 ± 0.1 mV（平均值±标准差）。所有表面均带负电，表面之间的差异在统计学上显著（所有p < 0.001）。

3.2 细胞数量分析（MTS）

本研究中使用的MTS比色试验与细胞接种后24小时附着在表面上的活细胞数量相关（图2）。结果相对于最高值归一化，即PE对照的值。不同PI组中的相对细胞数处于PE对照的62-70%水平，组间无显著差异。

图2. 接种后24小时在聚乙烯（PE，阴性对照）、乳胶橡胶（阳性对照）、传统聚酰亚胺（PI-2525）和两种不同固化的光敏PI（PI-2771-200、PI-2771-350）表面上的BHK-21细胞相对数量。数据通过MTS试验获得并归一化到最高光密度值。误差线表示标准差。

3.3 活/死分析

不同PI组中活/死染色细胞的所有图像看起来非常相似，因此，这里仅呈现PI-2525（图3A）。与乳胶橡胶（图3B）相比，所有测试的PI类型都具有高度细胞相容性，在乳胶橡胶中很少发现活细胞，死细胞很可能已脱落并漂浮在培养基中。

图3. 培养24小时后BHK-21细胞在（A）PI（PI-2525）和（B）乳胶橡胶（阳性对照）表面上的荧光活/死染色。活细胞：绿色，死细胞：红色。比例尺 = 200 μm。

活细胞和死细胞比例的定量分析结果与MTS评估一致。活细胞表面积（平均值±SEM）在PI-2525上最大（71,900 ± 8500 μm²，n = 13），其次是PE（70,400 ± 2900 μm²，n = 10）、PI-2771-200（67,300 ± 13,200 μm²，n = 8）、PI-2771-350（63,000 ± 5800 μm²，n = 8）和乳胶橡胶（1400 ± 320 μm²，n = 8）。唯一统计学显著的差异（p < 0.001）是乳胶橡胶与所有其他样品组之间的差异。PI-2525、PE、PI-2771-200、乳胶橡胶和PI-2771-350上的死细胞密度（平均值±SEM）均在相同范围内，相应值分别为13.5 ± 5.5、13.9 ± 5.4、18.8 ± 8.2、24.9 ± 8.6和30.8 ± 8.8 cells/mm²，组间无显著差异。

3.4 细胞覆盖的表面积

通过活/死染色样品的共聚焦扫描显微镜图像确定24小时时BHK-21成纤维细胞覆盖的表面积。细胞覆盖表面积的排序为PI-2525、PE、PI-2771-200、PI-2771-350和乳胶橡胶（图4）。聚酰亚胺和PE组之间无统计学显著差异。只有作为细胞毒性材料的乳胶橡胶与其他材料显著不同（p < 0.001）。

图4. 24小时时BHK-21细胞覆盖的表面积。聚乙烯（PE）和乳胶橡胶分别用作阴性和阳性对照材料。误差线表示标准差。

3.5 形态学观察

使用扫描电子显微镜成像监测不同PI表面上细胞的形态、附着和铺展。在每种PI表面上培养的BHK-21细胞在24小时后在大小和铺展方面显示出相似的形态（图5）。细胞表现出正常的成纤维细胞形态，它们通过丝状延伸（丝足）良好粘附，并已开始形成簇。

图5. 培养24小时后BHK-21细胞在PI-2525（A、D和G）、PI-2771-200（B、E和H）和PI-2771-350（C、F和I）样品上生长的SEM图像，三种不同放大倍数。

四、讨论

基底/封装材料构成了神经电极和假体中绝大部分的组织接触，因此必须满足高要求，以允许植入物的稳定长期功能。最佳绝缘材料应具有生物相容性和生物稳定性，并具有良好的介电性能。聚酰亚胺具有几个理想的特性，如机械柔性、化学稳定性、对金属的强粘附和适当的介电性能。PSPI的特殊特征——光图案化能力——通过消除定义神经植入物外形的复杂多级工艺（光刻、刻蚀）和通过封装层暴露电极部位的需要，简化了与传统PI相比的电极制造工艺。这些特征有利于植入物制造，允许以更低的成本和更高的良率进行工艺流程。由于其前驱体的不同化学和亚胺化动力学，PSPI的生物相容性存在一定的不确定性。传统PI已在许多先前的研究中被证明具有生物相容性。在本研究中，使用根据ISO-10993-5标准指南的体外试验确认了PSPI（PI-2771，HD MicroSystems）的无细胞毒性。PSPI薄膜在体外未对BHK-21成纤维细胞功能产生不利影响，因此似乎是植入式生物医学应用的有前景候选材料，尽管还需要阐明活体组织环境中可能的长期效应。

众所周知，不仅植入物材料化学，而且表面性质如粗糙度/形貌、能量和电荷也会影响生物材料的蛋白质吸附和细胞反应（例如，细胞附着、粘附、铺展、增殖和分化）。成纤维细胞偏好光滑表面。为了最小化样品之间的粗糙度差异，我们使用相同的旋涂程序生产所有PI涂层，最大转速高达5000 rpm。测量的粗糙度值对应于旋涂PI薄膜的典型值。PI-2771略微平坦的表面形貌可能是由于PI-2771的粘度（20 ± 5泊）低于PI-2525（60 ± 10泊）。然而，由于所有表面都非常光滑，Ra值小于1 nm，本研究中观察到的PI材料之间细胞反应的差异可能无法用样品粗糙度值的差异来解释。

已显示具有更高表面能的增加润湿性主要增强成纤维细胞的粘附和铺展。相比之下，研究人员报告，成纤维细胞在中等亲水性（即水接触角约55°）表面上比在更疏水性或更亲水性表面上更好地粘附、铺展和生长。PI-2525上的接触角（水和二碘甲烷）比PI-2771薄膜低约25-30°，即更有利于细胞附着。通常，化学和物理因素对接触角有影响。物理因素与表面形貌的变化有关，如表面粗糙度。然而，本研究中揭示的不同PI薄膜上表面粗糙度参数的差异如此之小，以至于我们可以得出结论，化学因素主要促成了接触角值的变化。PI-2525比PI-2771薄膜表现出更亲水的行为，这可能解释了为什么与更疏水的PI-2771薄膜相比，PI-2525显示出略微增强的细胞粘附和增殖特性。显然，PI-2771接触角可以通过使用等离子体处理或适当的表面涂层来降低，正如我们之前对聚丙烯所展示的那样。

生物材料表面的电荷被认为是影响细胞-生物材料相互作用的主要因素之一。当固体表面与液体接触时，表面电荷积累并建立电化学双层。在固-液界面附近，电荷载流子是固定的（所谓的固定Stern层），而在更大距离的液相中它们是移动的（移动层）。固定层和移动层之间界面处的电位称为zeta电位，可以通过电泳或流动电流/流动电位方法测量。我们使用流动电流方法，该方法允许计算正确的zeta电位，并考虑所有电导率效应，如贡献于zeta电位的表面电导。所有PI薄膜在pH 7.4下测量的zeta电位值均明显为负。在固定pH下，zeta电位越低，表面越有效地吸引带正电的颗粒并排斥带负电的实体，如阴离子或带电蛋白质。PI-2771-200具有最低值（-66.2 mV），而PI-2771-350的负电荷最少（-54.2 mV）。有趣的是，选择的固化温度对zeta电位有显著影响，但对表面接触角值没有影响。因此，研究生物材料表面zeta电位与蛋白质吸附/细胞反应之间的关系将有助于增强对材料与组织生物整合机制的理解，以及用于植入物和生物医学设备的进一步开发。

不幸的是，当植入中枢神经系统时，所有人工材料都有诱导胶质瘢痕组织形成的不便趋势，这可能导致植入物性能严重受损，因为激活的反应性星形胶质细胞的增殖和迁移能力增强，局部神经元密度降低，以及形成增加电极阻抗和降低信号幅度的封装层。毫无疑问，植入材料的组织反应取决于材料化学及其表面性质，而这些又取决于工艺参数。根据其制造商，PI-2771的推荐最终固化温度为350°C 1小时。在我们之前的微电极阵列研究中，我们使用较低的固化温度（200-300°C）以避免器件中钛和铂金属化层的混合以及随后的电极表面氧化和电极阻抗的显著上升。在我们看来，最终器件中残留的溶剂和光引发剂是固化温度过低的结果，它们可能导致纤维组织的不良生长。研究人员报告，与在完全固化（400°C）的PSPI上培养的细胞相比，在轻度固化（200°C）的PSPI上培养的成纤维细胞显示出粘附差、铺展有限和圆形形态，而在表面上有许多丝足铺展良好的细胞上则不同。在本研究中，未观察到这种现象。无论固化方案或PI等级如何，细胞都相似地附着和铺展，并带有几个丝足。然而，低固化温度的不利影响可能在组织中长期暴露时出现。

尽管使用了标准化良好、敏感、相对便宜且快速进行并与短期植入性能良好相关的体外试验，但它们不能提供植入体内时全身反应的信息。因此，需要进一步研究来阐明PSPI的体内反应，并确保不会有聚合物典型的不良长期效应，并且该材料适合慢性植入使用。此外，PSPI表面特性可以通过使用现代等离子体和沉积技术来定制和优化。